水貂病毒性腸炎病毒探針法熒光定量PCR試劑盒

產(chǎn)品及特點：

水貂病毒性腸炎病毒(Mink Enteritis Virus，MEV)會引起水貂病毒性腸炎，是以出血和壞死急劇下痢，白細胞高度減少為牲的急性病毒性傳染病。幼齡水貂有較高的發(fā)病率和死亡率，多數(shù)病貂轉(zhuǎn)歸死亡，大批發(fā)病和急性傳染，高度腹瀉并在稀便內(nèi)發(fā)現(xiàn)粘膜圓柱，白細胞顯著減少小腸病理切片上皮細胞增大，空泡變性包涵體出現(xiàn)等，均可作為斷本病的依據(jù)，該病毒的感染會給養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失，因此水貂病毒性腸炎病毒的快速準確鑒定對該病的預防和檢疫有著重要作用。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測水貂病毒性腸炎病毒的試劑盒。

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。

3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據(jù)水貂病毒性腸炎病毒高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他病毒 DNA發(fā)生交叉反應(yīng)。

5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。

規(guī)格及成分：

編號	成分	規(guī)格
試劑一	2×Probe qPCR MagicMix	500μL(本色蓋)
試劑二	熒光PCR專用模板稀釋液	1mL(黃蓋)
試劑三	水貂病毒性腸炎病毒qPCR引物混合液	100μL(白蓋)
試劑四	水貂病毒性腸炎病毒qPCR探針	50μL(棕色管)
試劑五	水貂病毒性腸炎病毒探針法qPCR陽性對照(1×10E8/μL)	50μL(紅蓋)
使用手冊		1 份

運輸及保存：

低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

自備試劑：

樣品 RNA。

使用方法：

一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）：

由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。

1. 標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。

6. 放冰上待用。重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備：

7. 如果有 N 個樣品，最好設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL 陽性對照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。

8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。

三、Probe qPCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進行）：

9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

成份	N+2 個樣品管	PCR 陰性對照管	標準曲線樣品管(2-7管)
2×Probe qPCR MagicMix	10μL	10μL	各10μL
水貂病毒性腸炎病毒qPCR探針	1μL	1μL	各1μL
水貂病毒性腸炎病毒探針法qPCR引物混合液	2μL	2μL	各2μL
N+2個待測DNA模板	7μL	--	--
超純水	--	7μL	--
第7步所得標準曲線樣品稀釋液(2-7號)	--	--	各7μL（2號樣到2號管，3號樣到3號管…）

11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行PCR：

過程	溫度	時間
預變性	95℃	3 min
PCR 反應(yīng)40個循環(huán)	95℃	15 sec
PCR 反應(yīng)40個循環(huán)	60℃	1 min(采集FAM通道的熒光信號)

四、數(shù)據(jù)處理：

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。若重復結(jié)果 Ct值小于 40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。

五、特別提示：

本公司的所有產(chǎn)品，僅可用于科研實驗，嚴禁用于臨床醫(yī)療及其他非科研用途！

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水貂病毒性腸炎病毒探針法熒光定量PCR試劑盒說明書
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