酶聯(lián)免疫吸附測定法（Enzyme-LinkedImmunoSorbentAssay；也稱ELISA）用特異性抗體或抗原捕獲樣品溶液中所含的目標抗原或抗體，利用酶反應(yīng)來捕獲目標抗原或抗體樣品溶液中所含的物質(zhì)，這是一種檢測和定量的方法。

 

  利用抗原抗體反應(yīng)的各種組合，通過將酶標記的抗原或抗體摻入反應(yīng)體系中，最終檢測酶活性為了檢測酶活性，使用吸收光譜根據(jù)反應(yīng)而變化的底物，并通過吸光度測量來定量。根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的組合方式，有直接法、間接法、夾心法、競爭法等方法。

 

  直接法

 

  直接ELISA（酶聯(lián)免疫吸附測定）是一種基于板的免疫吸附測定，在檢測和定量特定分析物（例如抗原、抗體、蛋白質(zhì)、激素、肽等）來自復(fù)雜的生物樣品。在四種不同的ELISA格式中，直接ELISA是最簡單、執(zhí)行速度最快的方法，但該方法也存在一些缺點（參見表1）。

 

  在直接ELISA中（圖1），抗原直接固定在多孔微量滴定板的表面，例如96孔聚苯乙烯板，然后與抗原特異性的酶標記一抗復(fù)合。一旦酶標記的一抗與抗原結(jié)合，綴合的一抗就會催化與其各自底物的反應(yīng)，產(chǎn)生可見的比色輸出，并通過分光光度計或吸光度酶標儀進行測量。直接ELISA適用于目標樣品中的定性和定量抗原檢測、抗體篩選和表位作圖。

 

  圖1.說明直接ELISA的設(shè)置：

 

  1.通過被動吸附將抗原固定在96孔聚苯乙烯板的孔上。

 

  2.將針對目標抗原特異的酶標記一抗（例如HRP標記一抗）添加到孔中并直接與抗原結(jié)合。

 

  3.添加相應(yīng)的酶底物（例如TMB(11012)，一種適合HRP的底物），與酶反應(yīng)后，產(chǎn)生可以通過分光光度計或吸光度酶標儀測量的可見比色輸出。

 

  優(yōu)點：

 

  ?需要更少的試劑和更少的步驟，使這種ELISA格式簡單快速，同時最大限度地減少潛在的用戶錯誤

 

  ?消除二抗的交叉反應(yīng)性

 

  缺點：

 

  ?抗原固定不具有特異性，導(dǎo)致潛在的高背景干擾

 

  ?一抗必須單獨標記，既耗時又昂貴

 

  ?無信號放大

 

  ?靈活性低——每種靶蛋白都需要特定的偶聯(lián)一抗

 

  ?一抗的免疫反應(yīng)性可能會受到酶標記的不利影響

 

  間接法

 

  酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)可以通過對其基本方案進行各種修改來完成。例如，直接ELISA使用酶標記一抗綴合物來檢測固定化抗原。然而，由于它只是1:1的化學計量比，因此放大或提高信號強度以方便或讀取以及更精確的測量是不可能的。

 

  間接ELISA在基線直接ELISA過程的基礎(chǔ)上又增加了一個步驟。選擇的抗原與實驗表面結(jié)合，并添加對其具有特異性的未標記一抗并與抗原結(jié)合。隨后，添加酶標記的二抗并與一抗結(jié)合。這不僅提供了可定制的信號，而且使特定實驗的過程具有更大的適應(yīng)性，因為二抗可以針對多個一抗。將無色底物引入樣品中，與酶綴合物發(fā)生反應(yīng)，并產(chǎn)生可測量的副產(chǎn)物。根據(jù)底物的選擇，該副產(chǎn)物可以是比色、化學發(fā)光或熒光的。

 

  研究人員在決定實驗方案中包含哪種檢測時必須考慮多個標準。下表列出了間接ELISA權(quán)衡的一系列因素。

 

  圖2說明比色間接ELISA的設(shè)置：

 

  1.用測試抗原包被ELISA板，密封板并在4°C下孵育過夜

 

  2.除去包被溶液并用所需緩沖液洗板2次

 

  3.用所需的封閉溶液在4°C下封閉板1小時

 

  4.用緩沖液洗板2次

 

  5.與未偶聯(lián)的一抗在室溫下孵育1小時

 

  6.用緩沖液洗板4次

 

  7.與HRP標記的二抗（在封閉緩沖液中）在室溫下孵育1小時

 

  8.用緩沖液洗板4次

 

  9.用ReadiUse?TMB底物溶液（貨號11012）在室溫下孵育板15-30分鐘。

 

  10.使用Signal Guard?HRP反應(yīng)終止液終止反應(yīng)（貨號11020）

 

  11.使用ELISA酶標儀測量650 nm處的吸光度信號

 

  優(yōu)點：

 

  ?易于獲取——多種預(yù)標記二抗可供選擇

 

  ?經(jīng)濟–需要更少的標記抗體

 

  ?高靈敏度–一抗含有多種表位，可結(jié)合多種標記二抗，從而導(dǎo)致信號放大

 

  ?非常靈活–單個二抗可用于檢測不同的一抗

 

  ?保留一抗的最大免疫反應(yīng)性

 

  ?不同的可視化標記物可以與相同的一抗一起使用（例如生物素/鏈霉親和素）

 

  缺點：

 

  ?二抗的潛在交叉反應(yīng)，導(dǎo)致非特異性染色

 

  ?與直接ELISA格式相比，實驗方案更長，因為該過程需要額外的孵育步驟

 

  三明治法

 

  三明治ELISA是許多研究應(yīng)用中最受歡迎的檢測選擇，它是獨一無二的。雖然它也像間接ELISA一樣使用兩種抗體與目標抗原結(jié)合，但其中一種抗體將首先用于包被實驗表面。微孔板徹底包被后，將目標抗原添加到樣品孔中并與第一抗體結(jié)合。然后將第二個抗體添加到微孔板中并與目標抗原結(jié)合，從而有效地將目標蛋白“夾在”兩個抗體之間。該測試具有高度特異性、高度靈敏性，并且具有不需要任何形式的樣品純化的優(yōu)點，因為只有目標抗原會受到兩種抗體的影響，從而能夠獲得出色的分析物濃度實驗讀數(shù)。然而，尋找合適配對抗體的費用和困難是主要的缺點。

 

  競爭法

 

  競爭/抑制ELISA解決了從與任何其他檢測版本相反的方向測量樣品中分析物濃度的問題。首先，使用已知抗原包被微孔板樣品孔。其次，添加測試樣品材料，最后引入酶標抗體以檢測結(jié)果。由于測試分析物與酶標抗體“競爭”結(jié)合，因此分析物的存在將降低與其濃度相稱的信號輸出。這種反向方法還允許測試未知樣品而無需純化，并且適用于廣泛的實驗。該技術(shù)的復(fù)雜性和難度與間接或夾心ELISA方案在時間和費用方面相似。

 

  上述為大家介紹elisa幾種常見的分類，每種分類有各自的特點，大家可以根據(jù)自身的情況選擇屬于自己elisa試劑盒的方法。