酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）是利用抗原、抗體的特異性免疫反應(yīng)與酶的催化反應(yīng)相結(jié)合建立起來的一項(xiàng)免疫檢測技術(shù)。而包被是ELISA實(shí)驗(yàn)第一步，也是比較關(guān)鍵的一步。ELISA包被是指將抗原或抗體結(jié)合到固相載體表面的過程，也稱為固相化。這個(gè)載體可以是96孔板，也可能是磁珠或其他材料。接下來，上海通蔚生物為大家介紹下酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）中優(yōu)化包被的方法。

圖1 為直接ELISA原理

  1、選擇合適的包被抗原

  包被抗原可分為天然蛋白、重組蛋白和小分子抗原。天然蛋白直接從生物樣本中提取的抗原，例如細(xì)菌、病毒或細(xì)胞等。這類抗原最接近自然狀態(tài)，但也容易混雜其它物質(zhì)，需經(jīng)純化才能用直接吸附法包被，對于含有雜質(zhì)較多的抗原可以采用間接捕獲法包被（先用能夠與目的抗原反應(yīng)的物質(zhì)如抗體直接吸附在酶標(biāo)板上，再通過特異性反應(yīng)使抗原固相化）；重組蛋白利用基因工程技術(shù)，在宿主細(xì)胞中表達(dá)的抗原。這類抗原純度較高，特異性好，一般可以直接包被即可；小分子抗原，例如多肽以及一些小分子有機(jī)化合物由于分子量小，缺乏足夠的結(jié)合位點(diǎn)，直接包被的效果往往不盡如人意，一般我們會(huì)采用載體蛋白偶聯(lián)法。將小分子抗原偶聯(lián)到分子量較大、具有較多結(jié)合位點(diǎn)的載體蛋白上，例如牛血清白蛋白(BSA)、卵清蛋白(OVA)等，借助載體蛋白的吸附能力實(shí)現(xiàn)間接包被。

  2、選擇合適的包被液

  常見的包被液有碳酸鹽緩沖液和 磷酸鹽緩沖液。碳酸鹽緩沖液最常用的ELISA包被液之一。pH值范圍一般在9.0-9.6之間，呈弱堿性；磷酸鹽緩沖液pH值范圍一般在7.2-7.4之間，接近生理pH值。如果包被的抗原在堿性條件下不穩(wěn)定的話，可以使用pH7.2的磷酸鹽緩沖液。

  3、包被的溫度

  常見的包被溫度室溫（18-25°C）、 4°C(冷藏)和37°C(孵育箱)。室溫（18-25°C）適用于大多數(shù)抗原和抗體。室溫包被操作簡便，通常需要過夜包被(12-16小時(shí))，或在搖床上孵育2-4小時(shí)； 4°C(冷藏)這種方法可以最大程度地保持其生物活性，但需要更長的包被時(shí)間，通常需要過夜包被(16-24小時(shí))； 37°C(孵育箱)這種方法可以縮短包被時(shí)間，但可能會(huì)增加一些不穩(wěn)定的抗原或抗體變性失活的風(fēng)險(xiǎn)。具體可以參考試劑盒說明書或相關(guān)文獻(xiàn)來了解目標(biāo)抗原或抗體的最佳包被條件。

  4、包被濃度選擇

  選擇合適的包被濃度對ELISA實(shí)驗(yàn)成功至關(guān)重要。過高過低的濃度都會(huì)影響實(shí)驗(yàn)的靈敏度、特異性和準(zhǔn)確性。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)估計(jì)初始濃度，一般來說，蛋白質(zhì)抗原和抗體的包被濃度范圍在1-10μg/mL之間。小分子抗原包被濃度可能需要更高一些，例如5-20μg/mL，因?yàn)槠浞肿恿枯^小，結(jié)合位點(diǎn)較少。關(guān)于包被合適的濃度，大家可以參考具體的說明書或相關(guān)文獻(xiàn)，也可以通過預(yù)實(shí)驗(yàn)優(yōu)化包被濃度，例如梯度稀釋法和分析結(jié)果法等。

  5、包被后的封閉選擇

  ELISA板的表面會(huì)殘留一些未被包被抗原/抗體占據(jù)的位點(diǎn)，這些位點(diǎn)容易吸附后續(xù)步驟中加入的檢測抗體、酶標(biāo)抗體等試劑，造成非特異性結(jié)合，導(dǎo)致背景信號增高，影響結(jié)果判斷。常用的封閉劑有0.05%-0.5%的BSA、10%的小牛血清、1%明膠、5%的脫脂奶粉等。大家可以進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)，比較不同封閉液的封閉效果，選擇最佳的封閉液。

  上述是通蔚生物為大家介紹elisa實(shí)驗(yàn)包被優(yōu)化的方法，通過了解ELISA包被的優(yōu)化方法，可以提升實(shí)驗(yàn)效果。如果您對ELISA實(shí)驗(yàn)還有疑問，歡迎咨詢我們在線顧問。