間接ELISA是一種常用的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)，用于檢測(cè)特定抗體，例如在感染性疾病診斷中檢測(cè)針對(duì)特定病原體的抗體。它通過使用二抗來放大信號(hào)，從而提高檢測(cè)的靈敏度。下面，我們將詳細(xì)介紹間接ELISA的原理和步驟。

間接ELISA原理

將純化的抗原包被在微孔板上。然后，加入待測(cè)樣本（例如血清），如果樣本中存在針對(duì)該抗原的特異性抗體（一抗），則一抗會(huì)與抗原結(jié)合。洗去未結(jié)合的一抗，以去除背景信號(hào)。接下來，加入針對(duì)一抗物種的酶標(biāo)二抗，二抗會(huì)與結(jié)合在抗原上的一抗特異性結(jié)合。再次洗滌以去除未結(jié)合的二抗。最后，加入酶的底物，底物被酶催化產(chǎn)生可檢測(cè)的信號(hào)，例如顏色變化。通過測(cè)量信號(hào)的強(qiáng)度，可以定量或定性檢測(cè)樣本中目標(biāo)抗體的含量。

間接ELISA步驟

步驟一：將已知抗原溶液加入到酶標(biāo)板孔中，在 37°C 孵育 1-2 小時(shí)，或室溫孵育 2-4 小時(shí)，使抗原吸附到酶標(biāo)板底部。最佳的孵育時(shí)間和溫度取決于所使用的抗原，可以參考自己試劑盒說明書進(jìn)行孵育。

步驟二：包被后，用洗滌液（例如 PBS-Tween 20）洗滌酶標(biāo)板 3-5 次，以去除未結(jié)合的抗原，用封閉緩沖液（如BSA或脫脂奶粉溶液）填充所有孔，封閉未結(jié)合的點(diǎn)，以防止非特異性結(jié)合。封閉步驟有助于減少背景信號(hào)，通常在室溫下孵育30分鐘至2小時(shí)或4℃過夜（孵育時(shí)間可以參考說明書），封閉后，再次用洗滌液洗滌酶標(biāo)板 3-5 次，以去除多余的封閉液。

步驟三：封閉結(jié)束后，將待測(cè)樣本（如血清、細(xì)胞培養(yǎng)上清等）用合適的稀釋液（例如 PBS-Tween 20）進(jìn)行稀釋。將稀釋后的樣本加入到相應(yīng)的孔中，同時(shí)設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。在 37°C 孵育 1-2 小時(shí)，或室溫孵育 2-4 小時(shí)，使抗體與包被的抗原充分結(jié)合。孵育結(jié)束后，用洗滌液（例如 PBS-Tween 20）洗滌酶標(biāo)板 3-5 次，以去除未結(jié)合的抗體。

步驟四：完成樣本孵育后，用洗滌液（例如 PBS-Tween 20）洗滌酶標(biāo)板 3-5 次，以去除未結(jié)合的抗體和其他樣本成分。洗滌時(shí)，將洗滌液注滿每個(gè)孔，靜置 1-2 分鐘后徹底倒掉，并輕拍酶標(biāo)板邊緣以去除殘留液體。重復(fù)此步驟 3-5 次，或根據(jù)實(shí)際情況調(diào)整洗滌次數(shù)。也可以使用洗板機(jī)進(jìn)行洗滌。

步驟五、加入針對(duì)樣本中抗體（例如人IgG）的酶標(biāo)記的二抗，該二抗需特異性識(shí)別一抗的物種來源（例如兔）。例如，如果一抗是兔來源的抗體，則需要使用針對(duì)兔IgG的酶標(biāo)二抗。二抗會(huì)與結(jié)合在抗原上的一抗結(jié)合。在 37°C 孵育 1-2 小時(shí)，或室溫孵育 2-4 小時(shí)。孵育結(jié)束后，用洗滌液（例如 PBS-Tween 20）洗滌酶標(biāo)板 3-5 次，以去除未結(jié)合的酶標(biāo)二抗。

步驟六：加入合適的底物溶液（如TMB或OPD），酶標(biāo)二抗中的酶會(huì)催化底物產(chǎn)生顏色變化。顏色的深淺與樣本中抗體的量成正比。在顏色達(dá)到合適的深度后，加入終止液（例如硫酸或鹽酸）來停止顯色反應(yīng)。使用酶標(biāo)儀在特定波長(zhǎng)下（例如，TMB為450 nm）讀取吸光度值。最后，根據(jù)吸光度值，結(jié)合標(biāo)準(zhǔn)曲線或其他方法，可以定量或定性分析樣本中抗體的含量。

  以上就是間接ELISA的基本原理和步驟。理解這些原理和步驟對(duì)于成功進(jìn)行間接ELISA實(shí)驗(yàn)至關(guān)重要。間接ELISA是一種用途廣泛的技術(shù)，可用于檢測(cè)各種抗體，并在傳染病診斷、免疫研究等領(lǐng)域具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。