巨噬細胞是適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的關(guān)鍵細胞，與許多疾病有關(guān)。可以使用巨噬細胞樣細胞系（如小鼠RAW264.7系）在體外研究它們。然而，細胞系是永生化的，通常不能反映細胞的典型功能。可以從小鼠骨髓中提取和培養(yǎng)原代巨噬細胞，并將其分化為骨髓衍生巨噬細胞(BMDM)。BMDM代表了巨噬細胞功能的更準確模型。由于原代細胞可能難以處理，我們整理了一些實驗技巧。

  以下是成功提取和培養(yǎng)BMDM的技巧：

  1.保持清潔。在切割骨頭邊緣之前，去除所有組織并用70%乙醇徹底清潔骨頭，以避免骨髓受到污染。骨頭的外部不是無菌的，這可能會污染下游培養(yǎng)物。還建議用青霉素/鏈霉素補充骨髓培養(yǎng)基，以進一步降低污染風險。如果可能，請在無菌環(huán)境中進行提取。骨頭外部的細胞最終可能會進入骨髓提取物中并長出巨噬細胞前體。

  2.制作單細胞懸浮液。使用針頭和注射器分離細胞團塊。骨髓可能會以大細胞團塊的形式被沖洗出來，但可以用針頭上下沖洗來分解這些細胞團塊，以制作單細胞懸浮液。一旦去除細胞團塊，還應(yīng)使用70uM細胞過濾器過濾細胞懸浮液以去除骨碎片。

  3.從骨髓中裂解紅細胞。這將濃縮您的樣本中的巨噬細胞前體并增加您的BMDM產(chǎn)量。

  4.細胞密度很重要。在進行分化之前，使用傳統(tǒng)血球計數(shù)器和顯微鏡對骨髓細胞進行計數(shù)和檢查其活力。骨髓細胞非常小，自動細胞計數(shù)器可能無法準確計數(shù)細胞濃度。骨髓細胞對其細胞密度很敏感：目標是1x10 6個細胞/毫升。

  5.使用合適的塑料。在非組織培養(yǎng)涂層塑料（無菌細菌培養(yǎng)皿）上分化巨噬細胞。否則它們會變得過于粘附，您可能無法將它們拆下重新接種用于實驗。

  6.堅持嚴格的細胞喂養(yǎng)。BMDM培養(yǎng)基必須含有巨噬細胞集落刺激因子( M-CSF )–可以使用重組形式的蛋白質(zhì)(10ng/mL)或來自自然分泌該蛋白質(zhì)的鼠成纖維細胞L929的條件培養(yǎng)基(培養(yǎng)基的20%v/v)。提取后第4天，向培養(yǎng)物中添加等量的新鮮培養(yǎng)基，從而使培養(yǎng)基體積加倍。逐滴添加以免擾亂細胞。提取后第7天，巨噬細胞將分化，現(xiàn)在可以分離并重新接種用于實驗。此后必須每48小時更新50%的培養(yǎng)基以保持細胞活力。不要完全更換培養(yǎng)基，因為原代細胞對其分泌的自分泌因子很敏感。

  7.不要干擾早期培養(yǎng)。雖然在提取后的幾天內(nèi)檢查細胞可能很誘人，但在前4天內(nèi)不要觸摸培養(yǎng)皿，以讓細胞附著。

8. 時機很重要。BMDM將在提取后7天分化。實驗（包括巨噬細胞極化（如果需要））應(yīng)從此時開始，持續(xù)時間不超過一周。此后，細胞可能不再代表巨噬細胞表型和基因型。

上述通蔚為大家介紹了如何培養(yǎng)骨髓巨噬細胞及成功提取和培養(yǎng)BMDM的技巧。希望上述內(nèi)容對您培養(yǎng)巨噬細胞有所幫助。